ࡱ> 02+,-./5@ 6bjbj22 sXX*V V V V r X0 ! ! ! ! !CCC>X@X@X@X@X@X@X$YRA\rdXK9C^CKKdX ! !"yXRRRK ! !>XRK>XRFRSVfV ! ;[ȶV oP42VVX0X:V,\P\zV\zV(C/FR H|I$CCCdXdXdV RV ANALISIS DE LAS CUASIESPECIES DEL VIRUS DE HEPATITIS C EN EL TRASPLANTE HEPTICO J. Moreno Garcia, R. Barcena Marugan, S. del Campo Terron, G. Moraleda Garcia. Servicio de Gastroenterologia, Hospital Ramon y Cajal, Madrid, Espaa. Persona de contacto: J. Moreno Garca. Servicio de Gastroenterologia. Hospital Ramon y Cajal. Ctra. Colmenar Km 9.1. 28034 Madrid. Espaa.  HYPERLINK "mailto:jmoreno.hrc@salud.madrid.org" jmoreno.hrc@salud.madrid.org INTRODUCCIN El virus de la hepatitis C (VHC) es el principal responsable de las enfermedades crnicas del hgado que requieren un trasplante heptico (TH) (1). La recidiva del VHC tras el TH ocurre en la mayora de los pacientes (2). VHC esta formado por una cadena sencilla de ARN de polaridad positiva y al igual que otros muchos virus ARN, el genoma del VHC presenta una elevada tasa de mutacin (3, 4). La diversidad gentica resultante, presente principalmente en la regin hipervariable (HVR-1) del gen de la envuelta (E2), hace al VHC existir en forma de cuasiespecies virales (5). Las cuasiespecies se pueden definir como una poblacin compleja de diferentes genomas cuyas secuencias solamente difieren en una pequea cantidad de nucletidos y que se encuentran presentes en un mismo individuo en un momento determinado (6). La evolucin de las cuasiespecies del VHC parece tener una gran importancia en la evasin del virus de la presin inmune; si esto fuese cierto, la persistencia de la infeccin por el VHC podra estar relacionada con la emergencia de variantes presentes entre las cuasiespecies (7). Los estudios realizados con pacientes trasplantados de hgado sugieren que existe una relacin entre el grado de inmunosupresin y la complejidad de las cuasiespecies (8). En este trabajo evaluamos si la terapia inmunosupresora modifica la evolucin de las cuasiespecies del VHC en pacientes trasplantados de hgado comparndola con pacientes inmunocompetentes infectados por el VHC. Nuestros hallazgos parecen demostrar que la diversidad de las cuasiespecies virales es menor en pacientes inmunodeprimidos. PACIENTES Y METODOS Los dos grupos estudiados consistieron en 11 pacientes que requirieron un trasplante heptico por cirrosis por VHC y 10 pacientes como grupo control. De todos los pacientes se obtuvo un consentimiento informado. Ambos grupos eran estadsticamente comparables por su edad, sexo, diagnostico histolgico y evolucin de la enfermedad. Los receptores recibieron como terapia inmunosupresora ciclosporina y prednisona. Las muestras de suero de los pacientes trasplantados fueron obtenidas antes y despus del trasplante correspondindose con las muestras basal y final de los controles respectivamente. La separacin temporal entre ambas muestras fue de 2810 meses y 3126 meses en trasplantados y no trasplantados respectivamente. RT-PCR del VHC. La regin HVR1 del VHC presente en las muestras de suero fue analizado mediante la amplificacin por transcripcin reversa utilizando cebadores dirigidos a la regin E2 siguiendo las condiciones descritas previamente (9). Los productos de la amplificacin fueron identificados en geles de agarosa al 2% y posteriormente sometidos a SSCP o anlisis mediante secuenciacin. Single-strand conformation polymorfism (SSCP). Los productos de la PCR fueron desnaturalizados en un buffer de desnaturalizacin en proporcin 1:1 a 95C durante 5 minutos y seguidamente mantenidos en hielo para evitar el reanillamiento de los productos de cadena sencilla. Las muestras son cargadas en un gel de poliacrilamida al 12% y son sometidas a una electroforesis durante dos horas a 25 mA. Las bandas fueron visualizadas mediante una tincin de plata para determinar el nmero de bandas. El nmero total de bandas es proporcional al nmero total de cuasiespecies presentes dentro de una nica muestra de suero determinando la complejidad gentica del virus que contiene. Secuenciacin del VHC. Los productos purificados de la nested PCR fueron clonados en un vector pMOSBlue (pMOSBlue blunt ended cloning kit, Amersham Pharmacia Biotech, UK) y el ADN de una media de 10 plsmidos fueron secuenciados utilizando un secuenciador automtico. La diversidad gentica intramuestra fue calculada como el nmero de cambios en nucletidos por el nmero total de nucletidos secuenciados en cada clon secuenciado de cada muestra. La diversidad intermuestra fue definida como el grado de cambios en secuencia de dos muestras del mismo paciente; fue utilizado para comparar las secuencias antes y despus del trasplante. Anlisis estadstico. Los valores cuantitativos fueron comparados usando el test de la t de Student. Un valor de la P<0.05 fue considerado estadsticamente significativo. Los clculos se realizaron utilizando el paquete SPSS. RESULTADOS El SSCP fue utilizado para determinar el nmero de cuasiespecies dentro de una muestra de suero determinada. En ambos grupos de pacientes, en cada par de muestras del mismo individuo (antes y despus del TH, en el caso de los pacientes trasplantados), la complejidad de las cuasiespecies no cambio considerablemente. (FIG 1). No se encontraron diferencias estadsticamente significativas en el numero de cuasiespecies cuando analizamos las muestras basal y final o pretrasplante y post-trasplante (7.32 vs. 6.73 en los pacientes control, respectivamente y 4.42 vs. 4.11 en los pacientes trasplantados, respectivamente). Tambin se analiz la aparicin y desaparicin de cuasiespecies en los sueros final y post-trasplante y tampoco se encontraron diferencias significativas entre las variables que desaparecieron y nuevas variables en el grupo control (2.82 vs. 2.32, respectivamente) ni en el grupo de trasplantados (2.52 vs. 2.21, respectivamente). (TABLA 1) Cuando se llevo a cabo el anlisis de secuenciacin para determinar el numero de cuasiespecies presentes en las muestras de suero basal y final, encontramos que la complejidad gentica fue significativamente menor en las muestras post trasplante en los pacientes trasplantados (0.0570.04 (pre-trasplante) vs. 0.0350.02 (post-trasplante); p=0.048). Sin embargo cuando analizamos los pacientes no trasplantados, no hayamos diferencias significativas en la diversidad gentica entre las muestras basales y finales (0.040.03 vs. 0.0660.04, respectivamente). (FIG. 2) (TABLA 2) DISCUSIN Ha sido propuesto que en la infeccin por VHC, las cuasiespecies virales juegan un papel importante en el establecimiento de la infeccin persistente (5). Este hecho podra inducir la recurrencia del VHC que generalmente ocurre tras el TH debido a la emergencia de nuevas variantes que confieren propiedades biolgicas al virus incluyendo la evasin de la presin del sistema inmune (2, 10). Nosotros investigamos si la terapia inmunosupresora podra modificar el patrn de complejidad de las cuasiespecies en individuos trasplantados de hgado comparndolos con un grupo control de pacientes no sometidos a TH. Con este fin utilizamos dos tcnicas diferentes para conocer la fiabilidad de cada una de ellas descubriendo que el grado de diversidad fue diferente utilizando ambas tcnicas. El anlisis de secuenciacin fue una tcnica ms sensible que el de SSCP que nosotros utilizamos. Otros estudios han demostrado que el SSCP permite la deteccin de cuasiespecies que representan el 5-10% de toda la poblacin viral, de modo que esta tcnica podra ser utilizada cuando sea necesario analizar un gran numero de muestras (9). Sin embargo, nosotros encontramos que utilizando el ensayo de SSCP, en comparacin con la secuenciacin, algunas variantes del VHC no pueden ser detectadas modificndose as el los resultados obtenidos. El efecto del uso de diferentes pautas de inmunosupresin sobre las cuasiespecies del VHC tras el trasplante no es aun conocido. Nuestros resultados muestran que la poblacin de cuasiespecies era ms homognea en los pacientes trasplantados despus de 28 meses que en los controles que no haban recibido un trasplante heptico (31 meses de seguimiento). Esto indica que la terapia inmunosupresora esta jugando un papel importante en la complejidad de las cuasiespecies. El mecanismo mediante el cual la inmunosupresin produce este efecto aun no es conocido. Otros estudios previos han demostrado que la complejidad gentica se vuelve constante 36 meses despus del trasplante en un grupo de pacientes con un estado de fibrosis 3 o 4 mientras que en un grupo con fibrosis 1 o 2 presentan un patrn de complejidad de cuasiespecies ms heterogneo (11); en cualquier caso, ambos grupos presentan pacientes inmunodeprimidos. Por lo contrario, en nuestro estudio, los pacientes trasplantados tenan una fibrosis 1 o 2 y sus variantes del VHC se comportaban de forma opuesta al del estudio de Lyra et al (11). Una explicacin a este hallazgo podra ser que en nuestro estudio comparamos pacientes inmunosuprimidos frente a pacientes inmunocompetentes. Por lo tanto la disminucin de la complejidad de las cuasiespecies podra estar asociada a la recurrencia de la hepatitis y la progresin de la fibrosis (12). De todos modos, son necesarios mas estudios para conocer los mecanismos implicados en el desarrollo de las variantes del VHC y como afectan las diferentes pautas de inmunosupresin a las cuasiespecies tras el TH. REFERENCIAS T. L. Wright, B. Pereira. Liver transpl Surg 1 (1995), p. 30. T. L. Wright, B. E. Donegan, H. H. Hsu et al. Gastroenterology 103 (1992) p. 317. Q. L. Choo, G. Kuo, A. J. Weiner et al. Science 244 (1989), p. 359. J. Holland, K. Spindler, F. Horodysky et al. Science 215 (1982), p. 1517. A. J. Weiner, M. J. Brauer, J. Rosenblatt et al. Virology 180 (1991), p. 842. M. Martell, J. I. Esteban, J. Quer et al. J. Virol 66 (1992), p. 3225. Y. K. Shimizu, M. Hijikata, A. Iwamoto et al. J. Virol 68 (1994), p. 1494. M. Martell, J. I. Esteban, J. Quer et al. J Virol 68 (1994), p. 3425. F. X. Lopez-Labrador, S. Ampurdanes, M. Jimnez-Barcons et al. Hepatology 29 (1999), p. 897 E. Domingo, J.J. Holland. Ann Rev Microbiol 51 (1997), p. 151. A. C. Lyra, X. Fan, D .M. Lang et al. Gastroenterology 123 (2002), p. 1458. A. L. Doughty, D. M. Painter, G. W. McCaughan. J Hepatol 32 (2000), p. 126. FIGURAS Y TABLAS  Tabla 1. Anlisis estadstico de las cuasiespecies del VHC en pacientes transplantados y controles mediante el anlisis de SSCP. Pacientes (n) Cuasiespecies basales Cuasiespecies desaparecidas Cuasiespecies nuevas Cuasiespecies finales Controles (8) 7.3 2 2.8 2 2.3 2 6.7 3 Trasplantados (9) 4.4 2 2.5 2 2.2 1 4.1 1 Los valores estn expresados como la media la desviacin estndar.   No trasplantado (media se)Trasplantado (media se)pn911n de secuencias basales82920.685 NSn de secuencias finales82920.650 NSp-distance intragrupo basal0.0400.030.0570.04p-distance intragrupo final0.0660.040.0350.020.046 S PACIENTES TRASPLANTADOS PACIENTES NO TRASPLANTADOS TH2 A B TH3 A B TH4 A B TH5 A B TH6 A B TH7 A B TH8 A B TH1 A B C1 A B C2 A B C3 A B C4 A B C5 A B C6 A B C7 A B C8 A B C9 A B FIG 1 Figura 1. Patrn de bandas obtenidas mediante el anlisis de SSCP de los sueros de pacientes trasplantados (TH1 a TH8) pre-trasplante (A) y post-trasplante (B) y de los sueros de pacientes controles (C1 a C9) basal (A) y final (B). Fig. 2a Fig. 2b Figura 2. rbol filogentico construido a partir de las secuencias obtenidas de un paciente trasplantado (2a) y un control (2b). En ambos casos los crculos blancos corresponden al suero pre-trasplante o basal y los crculos negros al suero post-trasplante o final, respectivamente. Tabla 2. Anlisis estadstico de las cuasiespecies del VHC en pacientes transplantados y controles mediante anlisis de secuenciacin. (NS: no significativo. S: significativo). QRb  - / E F G \ ^ j l r t u %"6rx G,S,T,n,,λԮԜ昜h1PmH sH hOSh1PhYh1P56h1P0JCJjh1PCJUjh1PCJUhYh1PCJ hYCJ h1PCJhOSh1P56CJh1POJQJ^JhYh1P6>*OJQJ^J6QRG %!"6;pdh $da$gdY$dha$$da$dh $dha$gdY26p !#% (F,G,S,T,,,(-r--.R...4///// $dha$gdY$hdh^ha$gdY $ & Fdha$$dha$,,,,--]-`-------.5.>.@.R......!/#/l/o////////11111122222222|hYB*CJaJphhYB*CJaJphf3 hYaJ0hYmH sH $jhY5CJU\mHnHu hY5\hYjhYCJUmHnHu"hYhY56CJaJmH sH  h1P5\h1Ph1PmH sH h1P5\mH sH 0/d0e0f0g0u0v000000000000 $$Ifa$gd1P$dh$Ifa$gd1P $dha$gdY0000000J;;;;;$dh$Ifa$gd1Pkd$$IfTFOr+)!@n@, t(0!634 Fa}T00011 1 1;kd$$IfTFr+)!@n@, t(0!634 Fa}T$dh$Ifa$gd1P 1 111'1(1011191:1B1$dh$Ifa$gd1P B1C1D11111JEEE:: $dha$gdYgdYkd$$IfTFr+)!@n@, t(0!634 Fa}T11111111111$dh$Ifa$gd1P $dha$gdY 111111cTTTT$dh$Ifa$gd1Pkd$$IfF\ lX  H t(0 634 Fa7111112cTTTT$dh$Ifa$gd1Pkd$$IfF\ lX  H t(0 634 Fa7222"2&2/2cTTTT$dh$Ifa$gd1Pkd$$IfF\ lX  H t(0 634 Fa7/202L2W2b2c2cTTTT$dh$Ifa$gd1Pkds$$IfF\ lX  H t(0 634 Fa7c2d22222cTTTT$dh$Ifa$gd1PkdQ$$IfF\ lX  H t(0 634 Fa72222222cXIDB=gdYgdY$hdh^ha$gdY $dha$gdYkd/$$IfF\ lX  H t(0 634 Fa7222222222333333 3!3&3/30353>3?3D3M3N3R3Y3Z3 $7$8$H$a$gdY2222333333 3!3.3/303=3>3?3L3M3N3X3Y3Z3d3e3f3p3q3r3|3}3~333333333333333333344444455666hYmH sH h1P hY5\ hYCJhYhYB*CJaJphhYB*CJaJphf3=Z3^3e3f3j3q3r3v3}3~333333333333333333gdY $7$8$H$a$gdY34444444444556666$hdh^ha$gdY$a$gdYgdYgdY,1h. 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